技術(shù)文章/ article

您的位置:首頁  -  技術(shù)文章  -  細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書

細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書

更新時(shí)間:2015-08-27      瀏覽次數(shù):2947

YIJI細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

主要用途

YIJI細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑是一種旨在通過機(jī)械或化學(xué)處理,差速以及等密度離心方法,從動(dòng)物細(xì)胞或軟組織中分離出完整的活性高爾基體細(xì)胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種動(dòng)物細(xì)胞或組織(人體、老鼠、兔子等)樣品中活性高爾基體的制備。可以被用于受體循環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成,以及抗體釋放機(jī)制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶,即到即用,性能穩(wěn)定,分離產(chǎn)量高。

技術(shù)背景

高爾基體(Golgi apparatus或Golgi body),又稱為高爾基復(fù)合體(Golgi complex),是大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞器組分,由40至100扁平片層或稱為小池(cisternae)堆疊成內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane system),分成正側(cè)或內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)(cis-Golgi network)、近內(nèi)中間網(wǎng)絡(luò)(medial-Golgi)、內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)(endo-Golgi)、外側(cè)或反側(cè)網(wǎng)絡(luò)等(trans-Golgi)細(xì)胞內(nèi)小管(tubules)、囊泡(vesicles)和小池(cisternae/sac)相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其主要功能在于由內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡中的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子,處理(修飾、分類)和組裝后,由外側(cè)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)分泌到目標(biāo)位置。同時(shí)也是合成蛋白聚糖(proteoglycan)和碳水化合物的重要場所。高爾基體的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一:*,通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞;第二,通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器;第三,可以通過等密度離心獲得高爾基體。 

產(chǎn)品內(nèi)容


YIJI清理液(Reagent A)   100毫升

YIJI裂解液(Reagent B)    30毫升

YIJI分離液A(Reagent C)    30毫升

YIJI分離液B(Reagent D)    30毫升

YIJI保存液(Reagent E)    70毫升

YIJI活性液(Reagent F)   200微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存YIJI活性液(Reagent F)在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里,有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液(YJ12028)或PBS緩沖溶液(YJ12033):用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(YJ12024):用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液(YJ12052):用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

8毫升超速離心管:用于超高速離心的容器

4℃(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品制備

4℃超速離心機(jī):用于樣品制備

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織

平式搖蕩儀:用于混勻

3號針筒和18號針頭:用于收集樣品

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,將試劑盒里的YIJI活性液(Reagent F)凍融,放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

細(xì)胞樣品

  • 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(5 X 107),直至細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
  • 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面,然后抽去
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
  • 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長表面
  • 置入37培養(yǎng)箱3分種
  • 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落
  • 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 移入一個(gè)15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為200g
  • 小心抽去上清液
  • 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
  • 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入預(yù)冷的3毫升YIJI裂解液(Reagent B)
  • 加入20微升YIJI活性液(Reagent F)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞(約20至40下)(注意:參見注意事項(xiàng)8
  • 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為3000g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)-70冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
  • 移取3毫升的YIJI分離液A(Reagent C)到8毫升超速離心管 
  • 小心加入3毫升的YIJI分離液B(Reagent D)在YIJI分離液A(Reagent C)的上面,避免震動(dòng)
  • 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在YIJI分離液B(Reagent D)的上面,避免震動(dòng)
  • 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4小時(shí),速度為100000g
  • 小心取出超速離心管:可見樣品和YIJI分離液B(Reagent D)交界處棕色或乳黃色樣品帶
  • 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管(注意:用3毫升針筒和18號針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸
  • 加入6毫升YIJI保存液(Reagent E)
  • 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘,速度為100000g
  • 小心抽去上清液(注意:為白色或絮狀沉淀,較為松散)
  • 加入500微升YIJI保存液(Reagent E),混勻
  • 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 放進(jìn)-70冰箱里保存
  • 組織樣品
  • 手術(shù)取出動(dòng)物組織,避免或去除脂肪組織,秤重以確定1克組織重量(實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)) 
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入5毫升YIJI清理液(Reagent A)清洗1次
  • 即刻用刀片切碎組織
  • 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的3毫升YIJI裂解液(Reagent B)
  • 加入20微升YIJI活性液(Reagent F)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約20至40下)(注意:參見注意事項(xiàng)8
  • 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為3000g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)-70冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
  • 移取3毫升的YIJI分離液A(Reagent C)到8毫升超速離心管 
  • 小心加入3毫升的YIJI分離液B(Reagent D)在YIJI分離液A(Reagent C)的上面,避免震動(dòng)
  • 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在YIJI分離液B(Reagent D)的上面,避免震動(dòng)
  • 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4小時(shí),速度為100000g
  • 小心取出超速離心管:可見樣品和YIJI分離液B(Reagent D)交界處棕色或乳黃色樣品帶
  • 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管(注意:用3毫升針筒和18號針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸
  • 加入6毫升YIJI保存液(Reagent E)
  • 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘,速度為100000g
  • 小心抽去上清液(注意:為白色或絮狀沉淀,較為松散)
  • 加入500微升YIJI保存液(Reagent E),混勻
  • 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 放進(jìn)-70冰箱里保存

注意事項(xiàng)

  • 本產(chǎn)品為10次(1克動(dòng)物組織或5 X 107細(xì)胞)操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 操作時(shí),避免污染母液,尤其是YIJI裂解液(Reagent B)、YIJI分離液A/B(Reagent C/D)YIJI保存液(Reagent E)
  • 樣品處理避免使用EDTA,否則影響分離效果
  • 所有操作均須在4或以下狀態(tài)進(jìn)行
  • 建議使用足夠的樣品量
  • 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
  • 通常勻化次數(shù)為20至40下(或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度:完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)
  • 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整YIJI分離液A/B(Reagent C/D)的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
  • 通常5 X 107細(xì)胞或1克動(dòng)物組織的高爾基體含量為15微克蛋白

11. 本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度和產(chǎn)量zui為理想

12. 高爾基體的標(biāo)志蛋白是UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶(UDP-glactosyl transferase);建議使用YIJI純化高爾基體UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶(UDP-glactosyl transferase)活性比色法定量檢測試劑盒YJ50414.3

  • 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正?;钚?/span>
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
版權(quán)所有©2024 上海一基實(shí)業(yè)有限公司 All Rights Reserved   備案號:滬ICP備17026694號-4   sitemap.xml技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)   管理登陸