酶的分離純化方法簡介

酶的分離純化方法簡介

生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。

酶的來源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。

因此，在提取某一種酶時，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶zui豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉價原料可以大量生產(chǎn)。

由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。

酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：

一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)

1.細(xì)胞破碎（cell disruption）

高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質(zhì)器兩次。是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人報道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過70Mpa時，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸菌更難破碎。

容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌（micrococcus lysodeikticus）43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。

2.離心

離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。過濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。

在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。該離心機(jī)又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如BTPX205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機(jī)的其他輔助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力量計、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?/font>